Miért érdemes a nemi hovatartozást biológiai változónak tekinteni a preklinikai kutatásokban?

Az emberi betegségek új gyógymódjainak felfedezésére irányuló orvosbiológiai kutatások során az egerek egyik nemét gyakran aránytalanul többet használják, mint a másikat – néha jogos tudományos okokból, néha pedig nem. Ha egy nemet kihagy a vizsgálatból, az torzíthatja a kutatást, és hibás következtetésekhez vezethet. Az állatok nem szerinti kiválasztásának tudományos indokain túl az etikai szempontokat és a 3R-t is figyelembe kell venni.

Miért lehetne előnyben részesíteni a nőstény egereket?

Bizonyos helyzetekben a nőstény egereket előnyben részesíthetik a hím egerekkel szemben, különösen az olyan specifikus törzsek esetében, mint a NOD.Cg-Prkdc^scid Il2rg^tm1Wjl/SzJ (NSG) and C57BL/6J (B6J). Az NSG egerek esetében azt javasolták, hogy a vérképző őssejt-(HSC)beültetés hatékonyabb volt nőstény recipiens egerekben, mint hím recipiens egerekben (Notta és mtsai, 2010, Gonzalez és mtsai, 2013). Egy újabb jelentés azonban azt mutatta, hogy míg a nőstény NSG egerekben magasabb humán HSC-beültetést figyeltek meg a korai időpontokban, a humanizált NSG egerek csontvelőjében és lépében a humán immunsejt helyreállítása nem mutatott eltérést a beültetést követő 16-20. héten (Borsotti és mtsai, 2017). Ezek a kutatók bebizonyították, hogy bár az immunsejtek specifikus alpopulációinak expanziós kinetikája eltéréseket mutat az expanzió és az érés során, a százalékos arányok és a sejtszámok kiegyenlítődnek a különböző gazdaszervezetekben, amint az összes leszármazás kifejlődött. Új preklinikai hatékonysági vizsgálatok kidolgozásakor a kutatóknak azt is figyelembe kell venniük, hogy az immunválaszok és a beültetett tumornövekedés kimutathatóan különbözik a nőstény és a hím NSG egerek között (Notta és mtsai, 2010, Gonzalez és mtsai, 2013, Martin-Padura és mtsai, 2010). Ezért a kutatóknak fontolóra kell venniük az NSG egerek mindkét nemének használatát, hogy teljes mértékben megértsék az immunválaszokat és a daganatos válaszokat az új terápiákra.

Az olyan beltenyésztett egerek esetében, mint a B6J, a nőstény egerek kutatásra való kiválasztása gyakran azon a feltételezésen alapul, hogy a hím egerek agresszívebbek, mint a nőstények, és a technikusok számára nehezebben kezelhetők. Ez a gender-specifikus különbség sok általános beltenyésztett törzsre is igaz, és ez a feltételezés sajnos lehetővé teszi torzítások kialakulását, és váratlan eredményeket eredményezhet a preklinikai vizsgálatok során. A beltenyésztett hím egerek agresszív viselkedése, beleértve a B6J-t is, összefüggést mutatott a neurokémiai aktivitás és a tesztoszteron különböző szintjeivel (Miczek és mtsai, 2001). A nőstény egerek agresszívek is lehetnek egymással és társaikkal szemben, de ez általában a szülés utáni társadalmi környezettel függ össze. Mindent összevetve, az egércsoportok összekeverése az agressziótól való félelem nélkül olyan tényező lehet, amikor a kutatók a randomizálást szeretnék fontolóra venni. Mindkét nem alkalmazása azonban lehetővé teszi a kutató számára, hogy megvilágítsa az új terápiákra adott gender-specifikus válaszokat.

Miért lehetne előnyben részesíteni a hím  ?

Érdekes módon bizonyos kutatási területek az ellenkező tendenciát mutatják, ahol történelmileg a hímeket választották a kísérletekhez. Azonban a hím egerekre való túlzott támaszkodás a gyógyszerfejlesztési folyamatban azt eredményezheti, hogy a nők nem megfelelő dózisban szednek gyógyszert, és még olyan mellékhatásokat is elszenvedhetnek, amelyeket a férfiak ritkán tapasztalnak. A nőstény egerek alulreprezentáltsága az orvosbiológiai kutatásokban azon a feltevésen alapul, hogy a nőstények eredményei alapvetően változékonyabbak, mint a hímekéi, amely megnehezítheti a kísérleti adatok értelmezését. A nőstényekről azonban kiderült, hogy nem változékonyabbak, mint a hímek (Becker és mtsai, 2016, Itoh és Arnold, 2015, Prendergast és mtsai, 2014).

Húsz évvel az Ambien (Zolpidem) gyógyszer forgalomba hozatala után az Egyesült Államok Élelmiszer- és Gyógyszerügyi Hatósága (FDA) felismerte, hogy a nők számára ajánlott adagot a férfiakéhoz képest felére kell csökkenteni (Zakiniaeiz és mtsai, 2016). A tanulmányok kimutatták, hogy a nőknél nagyobb a kockázata annak, hogy másnap reggel jelentős károsodást szenvednek olyan tevékenységek során, amelyek mentális éberséget igényelnek, beleértve az „alvó vezetés” eseteit is. Az a tény, hogy a nők a Zolpidemet lassabban választják ki szervezetükből, mint a férfiak, sokkal korábban kimutatható lett volna, ha a preklinikai vizsgálatok a nemet biológiai változónak tekintették volna, és a klinikai vizsgálatok előtt hím és nőstény állatokat is bevontak volna.

Az azonos törzshöz tartozó nőstény és hím egerek gyakran különböznek a betegség manifesztációjában és a kezelésekre adott válaszukban (Karp és mtsai, 2017). Számos tanulmány alkalmazta az adatbányászatot és/vagy az irodalmi felmérések elemzését, és feltárta, hogy a szakirodalmi publikációk körülbelül 50%-a nem számolt be sem az egerek neméről, sem életkoráról, és 10 tudományágból 8 mutatott nemi torzítást preklinikai vizsgálatai során (Beery és Zucker, 2011, Flórez-Vargas és mtsai, 2016). Az egerek mindkét nemének használata, valamint a nem és az életkor pontos jelentése rendkívül fontos a betegség progressziójának megértéséhez és az új terápiák értékeléséhez, amelyek mindkét nemhez tartozó betegek számára előnyösek.

A szexuális elfogultság ténye több biológiai tudományágban

Idegtudomány

Stephen Ferguson nemrégiben végzett tanulmánya feltárta, hogy a metabotróp glutamát receptor 5 (mGluR5) gátlása helyreállította a normális kognitív funkciókat és lelassította az amiloid-béta felhalmozódását Alzheimer-kórban (AD) szenvedő egerekben, de csak nőstényekben (Abd-Elrahman és mtsai, 2020). Valójában a nemi különbségek bejelentésének elmulasztása az egyik olyan tényező, amely hozzájárul a preklinikai vizsgálati adatok reprodukálhatóságának kudarcához és a klinikai gyógyszerfejlesztés későbbi szakaszaihoz (Collins és Tabak, 2014).

Szív-és érrendszeri betegségek

A szív- és érrendszeri megbetegedések 7-10 évvel később alakulnak ki a nőknél, mint a férfiaknál, és továbbra is a nők morbiditásának és mortalitásának vezető oka az Egyesült Államokban (Reitman, 2021). A preklinikai és klinikai vizsgálatokban azonban ennek a betegségnek az alulismertetése és a nemek közötti különbségek nőknél a kardiovaszkuláris események rosszabb megelőzéséhez és beavatkozásához vezetnek (Towfighi és mtsai, 2009, Flórez-Vargas és mtsai, 2016).

A szív- és érrendszeri betegségek klasszikus rizikófaktorai a nők és férfiak esetén azonosak, mint például a dohányzás, az elhízás és a magas vérnyomás, de ezeknek a tényezőknek a jelentősége és relatív súlya eltérő. Számos tanulmány vizsgálta a női specifikus kockázati tényezőket, és megállapította, hogy a premenopauzális hormonális diszfunkció és a terhesség alatti hipertóniás betegség erősen összefügg a szív- és érrendszeri betegségekkel (Towfighi és mtsai, 2009). A preklinikai vizsgálatok során a szív- és érrendszeri kutatások során leggyakrabban hím egereket tanulmányoznak. A szív- és érrendszeri betegségek egérmodelljeinek hím-elfogultsága eléri a 2,25:1 arányt (Flórez-Vargas és mtsai, 2016). Összességében ezek a tanulmányok azt sugallták, hogy mind a klinikai diagnózisoknak, mind a preklinikai vizsgálatoknak adott esetben nagyobb hangsúlyt kell fektetniük a nemhez kapcsolódó különbségekre.

Autoimmunitás

Az autoimmun betegségek közös patogenezissel rendelkeznek: az immunrendszer által közvetített támadás a szervezet saját szervei ellen. A világ népességének körülbelül 5-9%-át érinti, és a nők körében gyakoribb. A tanulmányok azt mutatják, hogy a nem jelentősen befolyásolja az autoimmun betegségek kialakulását, és azt javasolják a kutatóknak, hogy a modelleket nem szerint rétegezzék. A nemi különbségek lehetséges mechanizmusai közé tartozik a különböző immunválasz, a terhesség, a nemi hormonok, a genetikai hajlam, a szülői öröklődés, valamint az epigenetikai és környezeti tényezők (Ngo és mtsai, 2014). Például a sclerosis multiplex (MS) és a kísérleti agyvelőgyulladás (EAE) egérmodelljeiben a terhesség a tünetek enyhülésével jár együtt (Langer-Gould és mtsai, 2002). Ezek a megfigyelések soha nem lettek volna megtehetők, ha csak hím egereket vizsgálnak.

Egyéb

A jelentések szerint a hímek és a nőstények más betegségekre, például rákra és fertőző betegségekre való érzékenységükben jelentős különbségek mutatkoznak (Klein és mtsai, 2016). Ezenkívül az International Mouse Phenotyping Consortium (IMPC) egyik tanulmánya 10 intézményből, 14 000 vad típusú egérből és 40 000 mutáns egérből származó fenotípus-adatokat elemzett 234 tulajdonságra vonatkozóan. A tanulmány megállapította, hogy a nem egy szignifikáns változó, amely a tulajdonságok széles spektrumát befolyásolta, és a kezelés hatásának módosítójaként szolgál. Pontosabban, a minőségi jellemzők 9,9%-át és a mennyiségi tulajdonságok 56,6%-át szignifikánsan befolyásolta a nem. A génkiütött allél fenotípus módosítójaként a nem a kvalitatív adatsorok 13,3%-ában, a kvantitatív adatsorok 17,7%-ában befolyásolja a kezelés hatását, ha magasabb hamis felfedezési arányt alkalmaznak (Karp és mtsai, 2016).

Az NC3R csökkentési tanácsai

A Kutatásban részt vevő állatok pótlásának, finomításának és csökkentésének nemzeti központja (NC3R) egy független tudományos szervezet, amelyet azért hoztak létre, hogy vezesse az állatok kutatási célú felhasználását minimálisra csökkentő és az állatok jólétét javító új technológiák és megközelítések felfedezését és alkalmazását. Az NC3R tanácsot ad arra vonatkozóan, hogy a nemválasztás hogyan befolyásolhatja a kísérleti tervet:

„A szabályozók, a finanszírozók és a kiadók arra késztetik a kutatókat, hogy a kutatási folyamat minden szakaszában mindkét nemet tanulmányozzák. Gyakran azt a tévhitet használják, hogy a nőstény egerek eleve változékonyabbak, igazolásul, hogy csak az egyik nemet vegyék figyelembe. Az empirikus bizonyítékok nem támasztják alá ezt a nézetet. A hím és nőstény egereknél tapasztalt ellentétet összehasonlító metaanalízis, ahol az egereket az ivarzási ciklus ellenőrzése nélkül vizsgálták, azt eredményezte, hogy a variabilitás nem volt szignifikánsan nagyobb nőstényeknél egyik végpont esetében sem, de a hímeknél több tulajdonság esetében is.

A hím és nőstény állatok kísérletben történő alkalmazása lehetővé teszi az eredmények általánosítását a teljes populációra, és ezáltal javítja a kísérlet külső érvényességét. Nemek közötti különbségek vannak a betegségek előfordulásában, tüneteiben és progressziójában, valamint a kezelés hatékonyságában és a mellékhatásokban. A rágcsálókkal végzett nagyszabású vizsgálatok gyakran azt találják, hogy a nem módosítja a kezelés hatását. Azoknak a kutatóknak, akik csak az egyik nemet vizsgálják, alaposan meg kell indokolniuk ezt a tervezési döntést.”

https://eda.nc3rs.org.uk/experimental-designanimal-characteristics#sex-randomisation

A NIH és az FDA arra utasítja akutatókat, hogy a nemet biológiai változónak tekintsék

2014-től a NIH olyan irányelveket dolgozott ki, amelyek előírják a pályázóknak, hogy minden jövőbeni alkalmazásban jelentsék a preklinikai vizsgálatok során a hím és nőstény sejtek és állatok egyensúlyára vonatkozó terveiket, kivéve, ha a nem-specifikus felvétel indokolatlan és szigorúan meghatározott kivételeken alapul. A Nemzeti Egészségügyi Intézet (NIH) nemről mint biológiai változóról szóló politikája (Clayton és Collins, 2014) a következőképpen hangzik:

„A NIH arra számít, hogy a nemet mint biológiai változót figyelembe veszik a kutatási tervekben, elemzésekben és jelentések során a gerinces állatokon és embereken végzett vizsgálatok során. A tudományos irodalomból, előzetes adatokból vagy egyéb releváns megfontolásokból erős indoklást kell benyújtani azon pályázatoknál, amelyek csak az egyik nem vizsgálatát javasolják. A vizsgálókat határozottan arra bátorítjuk, hogy a pályázatok benyújtása előtt beszéljék meg ezeket a kérdéseket az NIH program munkatársaival.”

https://orwh.od.nih.gov/sex-gender

2015-ben az FDA hasonló útmutatást adott ki az ipar számára az állatszabályok szerinti termékfejlesztéssel kapcsolatban:

„Mindkét nemű állatokat be kell vonni, és meg kell indokolni a csoportok hím/nőstény összetételét. Az FDA elismeri, hogy bizonyos fajokhoz tartozó kifejlett állatok felhasználása tekintetében jelentős kínálati korlátok vannak. A megbízónak meg kell vitatnia a hatékonysági vizsgálatokban használt állatok életkorát és immunstátuszát a tervezett humán populációhoz viszonyítva. Az állatoknak a vizsgálatba való felvételére vonatkozó bevonási és kizárási kritériumoknak megfelelőnek kell lenniük, és azokat a vizsgálatok megkezdése előtt előre meg kell határozni.”

https://www.fda.gov/emergency-preparednessand-response/mcm-regulatory-science/animal-ruleinformation

Következtetés: Miért vehetik fel és kell felvenniük akutatóknak a nemet biológiai változóként?

A nőstények nem változékonyabbak, mint a hímek. Beery és Zucker szakirodalmi felmérése azt mutatta, hogy 10 tudományágból 8, különösen az idegtudomány (5,5 férfi-1 nő) és a gyógyszerészet (5 férfi és 1 nő) mutatott szexuális elfogultságot a preklinikai kutatásokban (Beery és Zucker, 2011). A nem reprezentatív tanulmányi elrendezés oka lehet az a feltevés, hogy a nőstények alapvetően változékonyabbak, mint a hímek, de lehet, hogy nem ez a helyzet. Itoh és Arnold tanulmánya 293 mikrosorozatú génexpressziós adatkészletet elemzett több mint ötmillió próba felhasználásával, és kimutatta, hogy a nőstény génexpresszió valamivel kevésbé változékony, mint a hím egereké (Itoh és Arnold, 2015). 293 cikk metaanalízise, amelyekben nőstényeket vizsgáltak az ivarzási ciklusok megszakítása nélkül, azt mutatta, hogy a nőstények viselkedési, morfológiai, fiziológiai és molekuláris tulajdonságaik tekintetében nem változékonyabbak, mint a hímek (Prendergast és mtsai, 2014).

Ha a nem jelentős hatással van a kezelésre adott válaszra, az adatok nemenkénti elemzése lehetővé teszi a kutatók számára, hogy meghatározzák az optimális dózist minden nem számára. Mint a Zolpidem gyógyszer példájában, lehetséges a hím és nőstény egerek eltérő reakcióinak kimutatása, ha az adatokat nemenként rögzítjük és elemezzük.

Költséghatékony, időt takarít meg, és támogatja a 3R-t, ha mindkét nemet használja a kutatásaira. Amikor tenyészpárokat állítunk fel kísérleti és kontroll kohorszok létrehozására, a nőstény és a hím egerek általában azonos számban jönnek létre. Mindkét nem felhasználásával a kutatók csökkentik a ketrecek fenntartásának költségeit létesítményükben, és jobban igazodnak az állatjóléthez is.

A nem szerepét az orvosbiológiai vizsgálatokban gyakran figyelmen kívül hagyták, annak ellenére, hogy egyes biológiai vizsgálatokban a szexuális dimorf hatásokra bizonyítékok vannak. Gyakorlatilag minden élettani vizsgálatban az egyetlen nemre való összpontosítás azzal fenyeget, hogy korlátozza a kutatási eredmények hatását, mivel az eredmények csak a lakosság fele számára relevánsak. Az orvostudományban tapasztalt eredmények többsége a férfibiológia tanulmányozásából származik. Dr. Janine Austin Clayton, a NIH női egészségügyi kutatásokért felelős igazgatója a New York Timesnak elmondta, hogy az eredmény: „Szó szerint kevesebbet tudunk a női biológia minden aspektusáról, mint a férfi biológiáról.” (Jackson G, 2020, november 13.)

A mindkét nemhez tartozó állatok és sejtek tanulmányozása kulcsfontosságú a tudományos felfedezések katalizálásában és a női biológia mélyebb szintű megértésében, ami számos kutatási területen megnyitja a nemi alapú kezelések lehetőségét számos betegség számára.

Szerző: Xingtong Liu, PhD
Technical Information Scientist II
The Jackson Laboratory